梯度洗脱原理,高效液相色谱梯度洗脱原理

液相色谱仪是利用液固或不互溶液体之间分配比的差异，先将混合物分离，再进行分析鉴定的仪器。广泛应用于生物化学、食品分析、医学研究、环境分析、无机分析等领域。高效液相色谱与结构仪器的结合是一个重要的发展方向。液相色谱仪的工作原理:系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。储液器中液相色谱仪的流动相由高压泵泵入系统，样品溶液通过进样器进入流动相，由流动相加载到色谱柱(固定相)中。由于样品溶液中各组分在两相中的分配系数不同，当它们相对运动时，经过反复的吸附和解吸分配过程，各组分的运动速度差异很大，被分离成单个组分，依次流出色谱柱，经过检测器时，样品浓度被转换成电信号传输到记录仪，数据以图谱的形式打印出来。HPLC仪器主要包括进样系统、输注系统、分离系统、检测系统和数据处理系统。下面将描述它们各自的组成和特性。

显影剂的比例取决于试验。一般根据文献报道的这类化合物用什么样的展开剂，先试用这类展开剂，然后不断尝试配比，直到找到分离效果好的展开剂。显影剂的选择条件:①对所需组分有良好的溶解性；②能分离成分；③待测组分的Rf在0.2 ~ 0.8之间，定量测定在0.3 ~ 0.5之间；(4)不与待测组分或吸附剂发生化学反应；⑤沸点适中，粘度低；⑥展开后，组分斑点圆而集中；⑦混合溶剂最好是新鲜配制的。

HPLC 原理如下:1 .高压:流动相是液体，流过色谱柱时受到很大阻力。为了快速通过色谱柱，必须对载液施加高压。2.速度快:分析速度快，载液流速快，比经典液相色谱快很多。通常分析一个样品需要15到30分钟，有些样品甚至可以在5分钟内完成，不到1小时。3.效率高:分离效率高。可以选择固定相和流动相，达到最佳的分离效果，比工业蒸馏塔和气相色谱仪高出许多倍。

5.应用范围广:高效液相色谱可以分析70%以上的有机化合物，特别是沸点高、大分子、极性强、热稳定性差的化合物的分离分析，显示出优势。6.色谱柱可以重复使用:不同的化合物可以通过一根色谱柱分离。7.样品体积小，易于回收:样品通过色谱柱后不被破坏，可以收集或制备单一组分。在高效液相色谱分析过程中，储液瓶中的溶剂被泵吸入色谱系统，然后输出，经过流量和压力测量后，再引入进样器。

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高效液相色谱以经典色谱为基础，引用了气相色谱的理论。技术上，流动相改为高压输送(最大输送压力可达4.9107 pa)；色谱柱以特殊方式填充小粒径填料，使柱效远高于经典液相色谱(每米塔板数可达数万或数十万)；同时在柱后连接一个高灵敏度的检测器，可以连续检测流出液。特点:1。高压:液相色谱以液体为流动相(称为载液)，液体流经色谱柱，受到的阻力很大。为了快速通过色谱柱，必须对载液施加高压。

2.高速:柱内流动相流速比经典色谱快得多，一般可达1 ~ 10 ml/min。高效液相色谱所需的分析时间比经典液相色谱少得多，一般不到1小时，3.高效:最近开发了很多新的固定相，大大提高了分离效率。4.高灵敏度:高灵敏度检测器已广泛应用于高效液相色谱，进一步提高了分析的灵敏度，比如荧光检测器的灵敏度可以达到1011g g，另外，样品量很小，一般只有几微升。