酶切鉴定原理,重组质粒的酶切鉴定

酶消化法检测PCR产物原理同上。双酶消化鉴定如何描述实验现象1，同步双酶消化同步双酶消化是一种省时省力的常用方法，单酶切一般只用于鉴定，当然，单酶切效率更高，更简单，但弊大于利，真正应用还是要用双酶切。酶消化需要培养大肠杆菌和提取质粒，他的原理是什么。

理论上是可以的，但在成本和时间上不可行；而且，DNA不是唯一的，同卵双胞胎的DNA是一样的。如果每个人都把自己的DNA序列输入数据库，就像我们的身份证一样。理论上是可以找到的。理论上是可以的，但是地球这么庞大的人口，估计还没调查完就耗光了。在很多情况下，DNA 鉴定起到了关键作用。在这些情况下，有许多不同的方法来提取DNA。

PCR(聚合酶链反应):类似于DNA的自然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。步骤:PCR由三个基本反应步骤组成:①模板DNA的变性:模板DNA加热到93℃左右一定时间后，模板DNA的双链DNA或PCR扩增形成的双链DNA解离，从而可以与引物结合，为下一轮反应做准备；(2)模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA加热变性为单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物延伸:DNA模板引物偶联物，在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，根据与半保守复制原理的碱基配对，合成与模板DNA链互补的新的半保守复制链，重复循环变性退火延伸三个过程，获得更多的“半保守复制链”，这个新链可以成为下一个循环的模板。

双酶切是用两种酶切割，两个酶切位点，因为单酶切自切割后会形成自组装，相当于质粒切割时质粒和质粒的自重组，因为形成的粘性末端是一样的，双酶切可以避免这种情况，连接时可以更有效的获得所需的重组DNA。当然，现在在实验室使用双酶是可行的。单酶切一般只用于鉴定。当然，单酶切效率更高，更简单，但弊大于利，真正应用还是要用双酶切。

质粒酶切后，电泳会产生与酶切位点数量相同的条带，可以用来判断质粒是否被切割。酶消化法检测PCR产物原理同上。如果是实际使用的话，可以试一个链接就知道了，或者电泳的时候点一个未切割的进行对比，迁移率会不一样。酶消化产物的电泳，质粒作为对照，如果完全切割，只有一条带位于质粒带之下，其大小通过参考标记来确定。PCR产物酶切时，如果切下的部分较小，不容易分辨，但一般情况下酶切后条带会变细变整齐；

菌落pcr速度快，可以做多次，但容易出现假阳性，一般用于初筛；质粒提取酶消化法是一定的方法，但耗时较长，通常是定型的。酶消化需要培养大肠杆菌和提取质粒。缺点是耗时，优点是结果可靠。菌落PCR只需将接种针或小枪头浸入菌落或菌液中，然后接入PCR系统，即可通过PCR判断目标条带的存在。优点是可以很快得到结果，缺点是可能会有假阳性。

1。同步双酶消化同步双酶消化是一种省时省力的常用方法。选择能使两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。NEB中的每一种酶都是随酶而来的。2.分步消化如果找不到适合两种酶的缓冲液，只能用分步消化。单个酶切的电泳道上会有几个亮带。而且你根据基因大小选择的波段也不一定是你想要的。原因是单酶消化形成的粘性末端完全一样，就像拼图一样，除了内容不同，两边完全一致。

双酶消化一般有三个带，只有一个正确的现象应该是很亮的。因为两种酶识别两个位点的切割，无论是质粒两端的粘端还是目的片段完全不同，还是拼图，内容不同，两端也不同，除了一种连接方式外没有其他联系。凝胶路线上的三条带是:靶片段带、空质粒带和最亮重组质粒带。

既然你的质粒已经提出来了，就不需要考虑感受态、转化等因素了。看双酶切后载体的位置有多少条带，如果有两条带，说明酶消化不完全。如果有一条带，说明酶消化效率没问题，pET28a的分子量是5.6k，你插入的片段是500bp。如果你的质粒被完全切割，载体与插入片段的摩尔比为1: 1，质量比为5.6k:0.5k，凝胶运行后两条带的亮度比为10:1，那么你的目标带很亮，很正常。