一步法rt pcr检测,PCR一步法

请教半定量的原理pcr并介绍博灵科做的半定量逆转录-聚合酶链式反应(半定量逆转录-聚合酶链式反应，Thermoscriptone-PCR试剂盒(一步Thermoscriptone-PCR试剂盒)非常方便实验。使用后比以前节省了很多时间，博灵科制作的thermoscriptone stepprcrkit(一步法耐热逆转录PCR试剂盒)是专门为一步法RTPCR实验准备的，使用该试剂盒，可以在同一个反应管中方便快捷地完成逆转录反应和PCR扩增反应。

Bolingke为您解答:RTPCR实验有三个步骤:RNA提取、RT和PCR。要求:1。RT前必须测RNA浓度，逆转录系统对RNA量还是有一些要求的，一般是500ng或1ug。2.RT按要求做，一般不会有大问题。3.PCR，和往常一样。但如果片段需要延伸，前两步的要求更高，需要一个完整的cDNA，不是简单改变Mg2 浓度和退火温度就能解决的。

病毒RNA提取分不同的样本，什么实验也分。一般来说，如果是血清血浆样本，大部分实验需要1ml样本，Qiagen和BIOG提取法都可以。因为提取病毒RNA比较困难，所以产量不会太高，但是不影响后续的PCR 检测。方法有很多(我从小木虫那里粘贴了一个完整的流程)，主流有三种。

为国家流感监测网络实验室检测技术方案提供甲型H1N1流感病毒实验室，不得用于商业活动或营利目的。一、标本采集类型和要求1。推荐的呼吸道标本类型以下标本应在发病后尽快采集:鼻拭子、咽拭子、鼻吸出物和鼻灌洗。气管插管患者还应收集气管吸出物。标本应置于无菌病毒采样溶液中，并立即用冰块或冰排保存或置于4℃(冰箱)中，并立即送至实验室。

)采样并填写人感染甲型H1N1流感疑似病例样本清单。(附表1)2。用于拭子选择的标本应使用带有铝或塑料手柄的合成纤维头(例如聚酯纤维)的拭子。不建议使用棉签和木柄。标本采集管应含有3 ml病毒取样液(含蛋白质稳定剂、防止细菌和真菌生长的抗生素、缓冲液)。3.临床标本应保存在4℃(不超过4天)或70℃或以下。

一步方法，使用专用引物，全程只需设置一个温度即可完成扩增。这种特殊的底漆是有专利的。两步法是在循环扩增中设置两个步骤。这种方法主要是扩增短片段，一个是95度变性，一个是退火扩增的温度，一般设定在55~60度之间，当然也有例外。三步法是常用的方法，扩增循环有三步:变性、退火、延伸。

博林克的5、...THERMOscriptOneStepRT-PCRKit( 一步法耐热反转录PCR试剂盒...

Thermoscriptone stepprcrkit(一步耐热逆转录PCR试剂盒)实验起来非常方便。使用后比以前节省了很多时间。博灵科制作的thermoscriptone stepprcrkit(一步法耐热逆转录PCR试剂盒)是专门为一步法RTPCR实验准备的。使用该试剂盒，可以在同一个反应管中方便快捷地完成逆转录反应和PCR扩增反应。

该试剂盒包括多点突变修饰的耐热免疫逆转录酶、热启动HotMasterTaqDNA聚合酶和RNA酶抑制剂混合物，还包括适用于逆转录和PCR扩增的优化的独特反应体系。与MMuLV相比，MMuLV(RNaseHˉ)酶缺乏RNaseH活性，具有更强的延伸性和稳定性，可用于长期cDNA合成和高比例全长cDNA文库构建。

半定量逆转录-聚合酶链反应(SQRT PCR)是近年来常用的一种简单、特异的定量RNA测定方法。通过将mRNA反转录成cDNA、PCR扩增和测定PCR产物的数量，可以估计样品中特定mRNA的相对数量。

该方法不设置“内标”，消除了两对不同引物之间的相互抑制和灵敏读数差异，具有明显的量效关系和良好的重复性。步骤:1。RNA提取，2。逆转录获得cDNA，3 .以cDNA为模板的PCR注意:第一步，RNA提取一定要质量好，注意污染。内参的选择常用于βactin和GAPDH。

其实一步方法并不是两步法的改进，根据实验目的不同，有时候两步法更好。比如你想同时扩增同一样本中两个以上的基因，那么一步方法就是从RNA开始，即分别取等量的RNA，然后进行逆转录，再加入不同的primerPCR，方法简单，但逆转录酶价格昂贵。如果采用两步法，可以将RNA逆转录成cDNA，然后每次加入等量的cDNA，再加入不同的引物进行PCR，可比性强，不需要逆转录就可以直接进行PCR。